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Orbitrap Exploris™ 480第1篇文献
发布时间:2019-12-27        浏览次数:397        返回列表
 今天跟大家分享的是Orbitrap Exploris480的第1篇文献,作者是来自丹麦哥本哈根大学的Jesper V. Olsen教授,文中对Exploris 480联合FAIMS Pro的性能进行了全面测试,包括DDA与DIA鉴定,灵敏度测试,组织样品测试,磷酸化样品测试,以及TMT与DIA定量等。

 

文献总结:

  • DDA-FAIMS:单个FAIMS CV电压,500ng Hela 肽段,21分钟梯度可鉴定3473个蛋白;
  • DIA-FAIMS:单个FAIMS CV电压,500ng Hela 肽段,每分钟可鉴定2500条unique肽段,配合21分钟短梯度每天可分析60个样品,且每个样品定量超过5000个蛋白;
  • 灵敏度测试:5分钟梯度,5ng Hela肽段中鉴定超过1000个蛋白;
  • 组织特异性蛋白分析:12种大鼠组织样品中TMT及DIA定量超过10000个蛋白;
  • 快速、灵敏、深度的磷酸化蛋白质组。

 

紧凑型四极杆-Orbitrap质谱仪

相比其它二合一的仪器,Exploris 480仪器是一个更紧凑更稳健的平台,且更易维护。该仪器与三合一系列中的Fusion Lumos及Eclipse有相同的离子源、接口,以及用户界面,因此可使用与三合一相同的前端选配件,包括FAIMS Pro接口以及内标校正EASY-IC源。同时,Exploris 480中的主动离子传输组件、四极杆、独立的电荷检测器以及多级离子通道组件均进行了全新的设计升级,提升仪器性能(图1)。

图1 Orbitrap Exploris™ 480仪器硬件示意图

 

DDA-FAIMS深度蛋白鉴定

扩大动态范围

样品:500ng Hela肽段

梯度:21分钟(60个样品每天)

鉴定结果:CV电压在-35V~-80V间,蛋白鉴定数目均高于不使用FAIMS,其中-75V时zui高,可鉴定3473个蛋白,比不使用FAIMS高出38%(图2A)。

图2A :21min梯度,500ng样品,不同CV电压时DDA-FAIMS以及DDA的蛋白鉴定

 

动态范围:与不使用FAIMS相比,DDA-FAIMS不仅可覆盖更多的蛋白,还可覆盖更深的Hela蛋白丰度分布,即更高的动态范围(图2B)。

图2B:DDA-FAIMS及DDA与Hela深度蛋白组的蛋白丰度分布叠加图

 

梯度影响:与不使用FAIMS相比,随着梯度的缩短,-75V CV时的优势更加明显。采用100个和200个样品每天的梯度时,分别增加41%和48%的蛋白鉴定数目(图2C)。由于文中采用的梯度均很短,而CV电压的切换需要25ms,因此单个CV电压条件zui为合适。当梯度延长时,可通过不同CV电压组合的方式进一步提高蛋白组覆盖。

图2C:不同梯度时DDA-FAIMS与DDA的蛋白鉴定对比

 

DIA-FAIMS进一步扩大蛋白深度鉴定,增加蛋白定量精度

样品:500ng Hela肽段

梯度:21分钟(60个样品每天)

鉴定结果:DIA-FAIMS的zui优CV电压为-45V,可鉴定5138个蛋白,蛋白与肽段鉴定数目均高于不使用FAIMS时(图3A),每分钟zui高可鉴定2500条肽段(图3B)。

图3A:21min梯度,500ng样品,不同CV电压时DIA-FAIMS以及DIA的蛋白鉴定;B:梯度中不同时间的肽段鉴定数目

 

定量精度:使用FAIMS时,71%的蛋白丰度在多次重复间CV值小于20%,54%的蛋白丰度CV值小于10%。而不使用FAIMS时,只有60%的蛋白丰度在多次重复间CV小于20%(图3C)。

图3C:DIA-FAIMS与DIA的多次重复蛋白丰度CV对比

 

极少量样品时的灵敏度测试

样品:5ng Hela肽段

梯度:5分钟(200个样品每天)

DDA结果:DDA只鉴定到26个蛋白,DDA-FAIMS实现10倍提升至281个蛋白(图4A)。DDA-FAIMS相比DDA更适用于极少量样品的分析,这是由于FAIMS可有效去除单价态的背景信号(图4C)。

DIA结果:DIA可鉴定547个蛋白,DIA-FAIMS可鉴定超过1000个蛋白(图4A),且FAIMS可提升DIA的定量重现性(图4B)。

图4A:5min梯度,5ng样品在不同方法下的蛋白鉴定数目;B:DIA与DIA-FAIMS方法中重复间蛋白丰度CV小于20%的蛋白数目;C:DDA与DDA-FAIMS时的单价态母离子分布对比

 

组织特异性蛋白定量分析

样品:来源于12种大鼠组织的酶解肽段(图5A)

图5A:大鼠组织特异性图谱工作流

 

梯度:21分钟(60个样品每天)

组织特异性蛋白图谱:每个组织所含肽段各有不同,从骨骼肌中可鉴定50000条unique肽段,到睾丸组织中可鉴定到100000条肽段代表超过10000个蛋白(图5B,C)。该数据集含有213000条unique肽段,覆盖12909个蛋白编码基因,可用于进一步数据挖掘以及作为DIA的谱图库。

图5B:不同组织中的肽段鉴定数目;C:不同组织中的蛋白鉴定数目

TMT-11定量:数据采集使用Turbo-TMT方法,可在15000分辨率下分析TMT11标的样品。每次实验代表一只大鼠,均可定量超过8000个蛋白,总共定量超过10000个蛋白(图6A)。

 

DIA定量:不同组织分别进行数据采集,用对应组织的谱图库进行数据分析。蛋白组在不同组织间存在特异性,在睾丸组织中可鉴定超过5000个蛋白,肌肉组织中能鉴定约2000个蛋白。合并不同组织结果可定量超过8000个蛋白,与TMT的覆盖率类似(图6A),且每分钟可鉴定超过600个蛋白(图6B)。

图6A:组织样品中DIA与TMT的蛋白及蛋白编码基因PCG的定量数目;B:两种方法每分钟定量的PCG数目

 

生物样品的重现性分析:分别使用TMT与DIA的数据对三个生物学重复进行主成分分析PCA。三个生物学重复在PCA图中距离接近,且小于不同组织之间的距离,这说明两种定量方式在生物重复间都具有高重现性(图6C,D)。

图6C:DIA定量的PCA结果;D:TMT定量的PCA结果

无监督层次聚类分析:DIA-FAIMS与TMT所得的蛋白表达谱十分类似,这说明这两种定量方法可提供类似的生物学信息(图6E)。

图6E:两种方法定量结果的无监督层次聚类结果

 

快速、灵敏、深度的磷酸化蛋白质组

样品:200μg Hela肽段经磷酸化富集,12个组织样品酶解肽段经磷酸化富集

梯度:21分钟(60个样品每天)

Hela样品:21分钟可鉴定超过8000条unique磷酸化肽段,其中超过5000条可靠定位至单个氨基酸上(图7A)。

图7A:200 μg Hela肽段经磷酸化富集后鉴定及定位的磷酸化肽段

 

组织样品:采用directDIA的方式,在12个组织样品中共鉴定到超过22000条unique磷酸化肽段,定位超过13000条磷酸化肽段(图7B)。

图7B:12个组织样品酶解肽段经磷酸化富集后鉴定及定位的磷酸化肽段

 

总结

  • Exploris 480联合FAIMS Pro适用于蛋白组学的各个方面,除了文中提到的DDA与DIA鉴定,极低量样品分析,组织样品,磷酸化样品,以及TMT与DIA定量等,还可实现BOXCAR-DDA,BOXCAR-DIA,SureQuant等定量工作
  • FAIMS可有效去除单价态的背景信号,可提高蛋白组覆盖,扩大动态范围,提高定量精度和准确性
  • TMTpro(TMT16标)将进一步提高TMT定量通量

 

全文链接

A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS InterfaceImproves Proteome Coverage in Short LC Gradients

 

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