公敬欣 史俊霞
引
言
近年来生物制药发展迅速，抗体药物大多存在翻译后修饰且种类复杂多样，因此研发过程中的质量控制显得尤为重要，其中电荷异质性是关键质量属性（CQA）之一，其可能影响生物制品的疗效，甚至有可能带来意想不到的副作用，从而影响药品的安全性和有效性，所以在抗体药物开发过程中选择一种灵敏度高、特异性强的电荷异质性检测分析方法，是控制和稳定抗体药物生产质量的有效手段。离子交换色谱技术广泛用于生物制药的开发以及抗体药物电荷变异体的分离。赛默飞离子交换色谱柱，从ProPac WCX-10开始，不断致力于为客户带来分析流程中的“金标准”。新产品ProPac 3R进一步完善应用方法，提供更优的分离度结果，并采用单分散填料解决批次重现性问题。它采用生物惰性材料设计，可以为蛋白质和AAV等分析提供可重复、高分辨率和耐用的强阳/阴离子交换色谱分离。
产品特点：“3R”亮点
Robustness：
高通量可轻松实现方法优化，在不同的pH值、温度、流动相组成下都具有优异的性能，并完全兼容MS。
Reproducibility：
出色的柱间重现性消除了后期开发过程中酸性或碱性变异体检测和鉴定的不确定性。
Resolution：
具有的单分散聚合物材料和亲水层，可显著提高分辨率，为电荷异质性分析提供一致的分离效果。
图 3 μm单分散ProPac 3R粒子（左）与3 μm多分散粒子（右）的SEM图像
案例分享1：双抗酸碱变异体分离
本案例采用ProPac 3R SCX (4x100 mm,3 μm)色谱柱在盐梯度下分离双抗的酸碱变异体，图1中该色谱柱有更好的分离结果，酸碱峰的分离度优于ProPac WCX-10 (4x250 mm, 10 μm)和MAbPac SCX-10 (4x250 mm, 10 μm)柱子的结果。且由于采用3 μm粒径，样品在相同的低浓度进样条件下，ProPac 3R SCX的峰型更尖锐，酸碱峰分离效果更好，灵敏度更高。
图1 ProPac 3R SCX色谱柱（黑色）、ProPac WCX-10（紫色）、MAbPac SCX-10（蓝色）盐梯度分离结果（点击查看大图）
案例分享2：三抗酸碱变异体分离
本案例采用ProPac 3R SCX (4x100 mm,3 μm)色谱柱在盐梯度下分离三抗的酸碱变异体，如图2所示该色谱柱有更好的分离结果，酸碱峰的分离度优于MAbPac SCX-10 (4x250 mm, 10 μm) 和ProPac Elite WCX (4x150 mm, 5 μm)柱子的结果。
图2 ProPac 3R SCX色谱柱（蓝色）、MAbPac SCX-10（黑色）、ProPac Elite WCX（紫色）盐梯度分离结果（点击查看大图）
在0.3 mL/min（图3）和0.2 mL/min（图4）的流速条件下，20分钟 50分钟盐梯度对比，50分钟梯度可以将难分离的碱性峰分得更好，流速对分离结果影响不大。并且由于ProPac 3R色谱柱采用单分散填料，降低流速并不会带来很严重的扩散效应。
图3 ProPac 3R SCX在0.3 mL/min的流速条件下，20 min盐梯度（紫色）和50min（黑色） 盐梯度的结果
（点击查看大图）
图4 ProPac 3R SCX在0.2 mL/min的流速条件下，20 min盐梯度（蓝色）和50min（黑色） 盐梯度的结果
（点击查看大图）
案例分享3：ADC酸碱变异体分离
本案例采用ProPac 3R SCX (4x100 mm,3 μm)色谱柱在CX-1 Buffer溶液pH梯度条件下分离ADC的酸碱变异体，如图5所示该色谱柱有更好的分离结果，酸碱峰的分离度优于MAbPac SCX-10 (4x250 mm, 10 μm) 和ProPac Elite WCX (4x150 mm, 5 μm)柱子的结果。
图5 ProPac 3R SCX色谱柱（黑色）、MAbPac SCX-10（蓝色）、ProPac Elite WCX（棕色）在CX-1 Buffer溶液pH梯度条件下分离结果（点击查看大图）
案例分享4：低等电点双抗酸碱变异体分离
本案例采用ProPac 3R SAX (4x100 mm,3 μm)色谱柱在盐梯度下分离低等电点双抗的酸碱变异体，如图6所示该色谱柱有更好的分离结果，酸碱峰的分离度优于ProPac WAX-10 (4x250 mm, 10 μm) 和ProPac SAX-10 (4x250 mm, 10 μm)柱子的结果。
图6 ProPac 3R SAX色谱柱（黑色）、ProPac WAX-10（蓝色）、ProPac SAX-10（紫色）在盐梯度条件下分离结果（点击查看大图）
案例分享5：AAV空实比分析
本案例采用ProPac 3R SAX (2x50 mm,3 μm)色谱柱在盐梯度下分析AAV1，AAV6和AAV8的空实比（图7）。
图7 ProPac 3R SAX在盐梯度下分析AAV1，AAV6和AAV8空实比色谱图（点击查看大图）
结
论
ProPac 3R色谱柱在双抗、三抗、ADC、重组蛋白和AAV空实比分析中均表现出优越的分离性能和很高的灵敏度，且单分散的填料保证了批与批之间结果的稳定性，方法耐用性的标准进一步提升。ProPac 3R色谱柱的单分散聚合物材料和亲水层，使得该色谱柱可以采用质谱兼容的缓冲体系，保证酸碱峰同样具有良好的分离性能，完成在非变性质谱条件下，对酸碱变异体来源的直接鉴定。
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